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#00705ロンザの骨格筋筋芽細胞(HSMM)は分化(デスミン生成)するまでに、どのくらいかかりますか?また、同様に骨格筋細胞(SkMC)の場合についても教えてください。

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:56 +0000

通常、50-70%コンフエンスに達した場合に筋芽細胞は多核筋管を形成します。筋管は多数の筋芽細胞の結合により形成されています。だいたい51%コンフルエンスに到達した時に分化培地を加えると、筋管の成長を促進します。培養方法についてはそれぞれのプロトコルを参照し、すすめてください。なお、HSMMとSkMCを比較すると、分化速度はSkMCが遅い傾向があります。

#00703ロンザの骨格筋筋芽細胞(SkMC)用推奨培地のSkGMTM BulletkitTM と骨格筋細胞(HSMM)用推奨培地のSkGMTM-2 BuletkitTMの違いを教えてください。

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:56 +0000

SkGM BulletitTMはSkMCの増殖するよう最適化されており、もともと本製品のみが販売されていました。その後、HSMM細胞の提供を始め、その際にHSMMの増殖用BulletkitシステムとしてSkGM-2の提供するようになりました。それぞれの組成は以下ですが、SkMC細胞⇔SkBM , HSMM細胞⇔SKBM-2、　での組み合わせにおいて確認試験をおこなっておらず、組み合わせを変えた場合の増殖能への影響は分かりかねます。極力、それぞれ推奨培地をご使用ください。
[培地]
SkBM：無血清、
SkBM-2：無血清、L-グルタミン含まず
[添加因子]
SkGM：hEGF, インシュリン、フェチュイン、デキサメタゾン、GA-1000、BSA
SkGM-2：rhEGF、デキサメタゾン、L-グルタミン、GA-1000、FBS

#00700ロンザの骨格筋細胞(SkMC)と骨格筋筋芽細胞(HSMM)との大きな違いを教えてください。

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:56 +0000

弊社の骨格筋細胞(SkMC)は胎児組織由来、一方骨格筋筋芽細胞(HMSS)は乳幼児を含む成人由来（1～40才まで）の製品となっております。また相違点としては、骨格筋筋芽細胞(HSMM)のほうが骨格筋細胞(SkMC)よりも分化後のデスミン陽性率が高い傾向があります。

#01040プロトコルで推奨される指定播種密度を上回る密度で細胞を播種することはできますか? また、一般的な初代細胞が耐えうるDMSOの最低希釈値を教えてください。

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:56 +0000

推奨播種密度は、下記2つの目的のために設定されています。
1. 残留DMSOを十分希釈し、細胞を接着させるため
2. 継代ごとに倍化数が最大となるようにするため
これまでの弊社の経験上、多くの初代細胞は培地中に残存するDMSOの影響よりも、溶解直後の遠心分離によるダメージのほうが大きいことがわかっています。このため、細胞保存溶液中のDMSOを取り除くための遠心分離は、細胞バイアルを溶解した直後には実施しないようご注意ください。ロンザで扱う多くの初代細胞は、溶解直後の遠心操作はせずに、推奨播種密度で培養するよう推奨されています。多くの研究者の間では、DMSO濃度の閾値は1%程度というのが一般的な見解です。ロンザ初代細胞の多くは、10%DMSOを凍結保存溶液中に添加していますので、凍結バイアルを融解したら少なくとも10ml の培地を加え希釈したうえで培養しないと、生存率や接着率に影響を与えかねません。理想としては、少なくとも20ml以上の培地で希釈し播種することが推奨されます。またこれに関係なく、初期の培養播種密度がプロトコールに指定される播種密度でない場合には、保証対象外となりますのでご注意ください。
培養初期の初代細胞を推奨播種密度で培養する事で、1継代あたりの分裂能を最も増やすことが可能です。培養初期に指定播種密度で複数のフラスコに播種すると、コンフルエンシーに至るまでの時間は長くなりますが、高い比率での分割が可能となります。また、推奨播種密度で培養する事により、継代作業を最低限にし、次の継代までに要する時間を最大限にします。継代操作は細胞にとって非常にストレスがかかる作業になる一方で、細胞の健康状態や形態を最も良い状態で維持するためには必要な作業です。ロンザ初代細胞の多くは増殖のために細胞間相互作用が必要です。指定播種密度を下回る条件で培養した場合には、増殖しなくなったり死滅してしまったりする場合がありますのでご注意ください。

#01039プロトコルではDnaseⅠを使用することが推奨されていますが、DNaseⅠの使用は必須でしょうか。また、取り除くタイミングがあれば教えてください。

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:56 +0000

弊社の血球系細胞製品群(Poietics cell)は、解凍時に細胞が凝集してしまうのを防ぐ目的でDnaseⅠ処理によりゲノムを細断化します。
最終的に遠心により洗浄が行われた後は、DNaseⅠ不含の通常の培地で培養が可能です。

#00861ロンザの皮膚細胞の単離部位を教えてください。

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:57 +0000

弊社の成人皮膚細胞(ケラチノサイト、微小血管細胞、線維芽細胞、メラノサイト)は美容形成手術によって得られた皮膚組織から単離された製品です。多くの成人皮膚細胞は腹部脂肪除去手術により得られておりますが、一部他の入手経路として乳房形成、太ももや上腕の脂肪除去手術などからも得られています。また非常に稀ではありますが死体から皮膚を採取するケースもあります。また、新生児皮膚細胞（ケラチノサイト、微小血管細胞、線維芽細胞、メラノサイト）は新生児の割礼の際にえられた包皮組織から単離されています。

#01058RAFT™ 3D Cell Culture System で培養した場合と平面培養時の蛍光免疫染色でのプロトコルの違いを教えてください。

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:59 +0000

蛍光免疫法による標識は平面培養でもRAFT™ 3D Cell Culture System においても一般的にプロトコルに違いはありません。スフェロイドの状態の細胞を染色する際には、内部にある標的タンパク質に抗体を反応させるため、透過処理が必要となります。具体的なプロトコルは弊社のテクニカルノートを参照ください。

#01057RAFT™ 3D Cell Culture System のゲルで培養した細胞で蛍光免疫染色を行う場合、RAFT™ ゲルによりバックグラウンドが高くなることはありますか?

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:59 +0000

RAFT™ 3D Cell Culture System を利用した線維芽細胞もしくは癌細胞の蛍光免疫の結果(テクニカルノート参照）では、抗体とRAFTTMに含まれるコラーゲンとの交差反応はみられず、また、抗ラットチューブリン1次抗体に対する抗ラット2次抗体も交差反応は示しませんでした。コラーゲン自体は若干の蛍光バックグランドを示し、また、BSAを含むブロッキングバッファーで希釈した抗体を使用した場合にもこのようなバックグランドが見られます。

#01054RAFT™ 3D Cell Culture System で作製したゲルはどのように細胞培養するのですか?

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:59 +0000

RAFT™ で作製されたゲルの上に培地を添加し、平面培養時と同じように細胞を培養してください。RAFT™ 3D Cell Culture 内の細胞数が多い場合は、消費が早いため、培地の量を倍量にする、培地交換頻度を増やすことが必要です。24well インサート用のRAFTシステムにおいては、下部(ウェル）と上部（インサート）では、同じ培地あるいは異なる培地を使用することも可能です。

#00883ロンザの成人由来のメラノサイトはエンドセリン-3(ET-3)を加えて培養していますが、新生児には培養されていません。なぜ相違があるのか教えてください。

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:57 +0000

成人のメラノサイトは新生児と比較して倍加速度が非常に遅いため、成人にエンドセリン-3（ET-3）を添加した培地にて培養しています。新生児メラノサイトは、増殖も速いためET-3は必要ありませんが、害となることもありません。

#00865KGMTM-2, KGM-GoldTMとKGM-CDTMの相違点を教えてください。

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:57 +0000

KGMTM　　　　 :初代開発培地
KGMTM-2　　 :2世代目
KGM-GoldTM　:3世代目(推奨培地）
KGM-CDTM　 :基地組成培地(無血清、動物由来成分不含）(推奨培地）

全4種類のロンザケラチノサイト培地は、すべて無血清培地で類似の培地ですが、最も推奨するのはKGM-Gold™ と KGM™-CDです。
ケラチノサイト用の培地で初代に開発された培地はKGM™ であり、エピネフリンとトランスフェリンを加え更なる改良をした2世代目がKGM™-2で、初代のKGM™ に比べ20%ほど早く増殖し、倍加数も増えました。更に基礎培地、および添加因子濃度を改良し、3世代目の KGM-Gold™ が開発されました。KGM-Gold™ は、KGM™ や KGM™-2 に比べ、より低密度で維持培養が可能であり、また接着率が高く増殖率も良い培地条件となっているため高密度での培養が可能であり、分裂回数が増えても本来の形態を維持したケラチノサイトを培養することが可能となりました。
なお、ロンザが提供するすべてのケラチノサイトは、KGM-Gold™ で採取しているため、KGM™ や KGM™-2 で培養したケラチノサイトをKGM-Gold™ へ変更して培養することは可能である一方、KGM-Gold™ で培養したケラチノサイトはKGM™ や KGM™-2へ変更して培養することはできません。KGM-Gold™ や KGM™-CD の使用が推奨です。
もし既知組成培地の必要性がある場合にはKGM™-CD をご利用ください。KGM™-CD は、KGM™ 培地と類似した生育能を有しますが、脳下垂体抽出物を含有せず、他の動物由来成分を含有しない培地としてご利用いただけます。既知組成培地を必要としない場合、もしくは既存組成培地であるKGM™ やKGM™-2 で細胞株やご自身で採取したケラチノサイトを用いた論文の再現実験を行う場合を除き、まずはKGM-Gold™ の利用を推奨いたします。

#00864ロンザのケラチノサイトの角質細胞への分化を阻害する要因を教えてください。また、ケラチノサイトはカルシウム不含で培養することはできますか?

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:57 +0000

ケラチノサイトの分化は、カルシウムを含有する培地で培養することで促進可能です。無血清培地における低濃度カルシウムは、ケラチノサイトの角化へ向かう分化誘導を抑制します。
ロンザが提供するケラチノサイト用のカルシウム不含培地を使用すれば、カルシウム濃度を変えることも可能です。カルシウムが全く含まれない培地においては、ケラチノサイトは接着も増殖もしません。良好な接着と生存率を維持するためにも、カルシウム不含培地に対して終濃度0.03mMもしくはそれ以下の濃度でカルシウム添加をされることを推奨します。低カルシウム濃度では、ケラチノサイトの増殖率は遅くなりますが、分化率も低く抑えることが可能です。ロンザで提供している標準的な培地；KGM™ や KGM™-2 培地は、いずれもカルシウムを 0.15 mM含有しています。また KGM-Gold™ 培地においては、カルシウムを 0.10 mM含有しています。

#00863ロンザのケラチノサイトの角質細胞への分化はどのように行えばよいでしょうか。

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:57 +0000

弊社のケラチノサイトの分化は血清の添加、またはカルシウム濃度の増加によって分化誘導させることができます。プロトコルに従いすすめてください。不明な場合はテクニカルサポートにお問合せください。

#00900ロンザの骨格筋細胞(SkMC)もしくは骨格筋筋芽細胞(HSMM)を筋管に分化した後、筋芽細胞に脱分化させることは可能ですか?

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:58 +0000

弊社の骨格筋細胞(SkMC)もしくは骨格筋筋芽細胞(HSMM)の筋管形成は最終分化となります。さらなる脱分化させることはできません。

#00901ロンザの骨格筋細胞(SkMC)もしくは骨格筋筋芽細胞(HSMM)が筋管に分化した後、その状態で培養、維持、凍結保存することは可能ですか?

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:58 +0000

HSMMが分化した筋管細胞は、SkGM™-2 BulletkitTM で、またSkMCが分化した筋管細胞は、SkGM™ BulletkitTM でそれぞれ維持培養が可能であり、2日に一度培地交換をすることで約 2-3週間維持培養が可能です。一度分化誘導を行ったら、継代せずに使用するべき細胞です。分化誘導した細胞は有糸分裂後、トリプシンではがすと接着しなくなってしまいます。最終分化した細胞は、培養容器の表面からだんだんと剥離してきます。この状態で再凍結保存した細胞は、解凍し再培養したとしても、ほとんどの細胞が死滅します。

#00925ロンザで推奨する破骨前駆細胞（OCP）の培養容器を教えてください。

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:58 +0000

弊社の破骨前駆細胞(OCP)は96well プレートに播種するようプロトコルには記載しています。

#00924ロンザの骨芽細胞(NHOst)の分化・機能を確認する推奨TRAPキットは販売されていますか?

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:58 +0000

弊社ではTRAPキットを販売していません。ロンザの破骨細胞の分化・機能の確認方法としてシグマ社のTRAPキットを使用しています。(Sigma-Aldreich社カタログ番号：386A)

#00902ロンザではなぜ骨芽細胞(NHOst)を分化する際、Hydrocortisone-21-hemisuccinate と β-Glycerophosphate　の組み合わせで複数の濃度条件を検討するよう推奨しているのですか?

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:58 +0000

骨芽細胞(NHOst)を分化する際、hydrocortisone-21-hemisuccinate と β-glycerophosphate を必ず使用してください。骨芽細胞(NHOst)はhydrocortisone-21-hemisuccinate と　β-glycerophosphate に非常に敏感であることを確認しています。ドナー(ロット)によっては、それらを高濃度にて用いると分化を早める場合もある一方で、細胞剥離を誘導する要因となる場合もあります。より詳しい情報をお知りになられたい場合はテクニカルサポートにお問合せください。

#00862ロンザの新生児のドナーから得られた皮膚細胞のドナー年齢を教えてください。

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:57 +0000

弊社の新生児由来の皮膚細胞につきましては、たいていは生後数日以内、もしくは生後数週間(1～2週間)以内から採取された組織です。新生児の割礼は少なくとも48時間以内に行われるのがアメリカでの病院の慣習です。またカリフォルニア州の病院では1～2週間に行われるようです。ただし、極めてごくまれに3～4歳でも割礼は行われる場合はあるようです。

#00364現在使用している細胞用の最適化プロトコルでは、一定の播種密度で播種することが推奨されていますが、これよりも低密度で細胞を播種することはできますか?

ロンザジャパン — Wed, 14 Sep 2016 06:00:53 +0000

ネガティブの影響をもたらす際にはより低密度での播種を試していただけます。その際は、フィーダーレイヤーや馴化培地を使用してお試いただくいことをお勧めします。

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#00705ロンザの骨格筋筋芽細胞(HSMM)は分化(デスミン生成)するまでに、どのくらいかかりますか?また、同様に骨格筋細胞(SkMC)の場合についても教えてください。

#00703ロンザの骨格筋筋芽細胞(SkMC)用推奨培地のSkGMTM BulletkitTM と骨格筋細胞(HSMM)用推奨培地のSkGMTM-2 BuletkitTMの違いを教えてください。

#00700ロンザの骨格筋細胞(SkMC)と骨格筋筋芽細胞(HSMM)との大きな違いを教えてください。

#01040プロトコルで推奨される指定播種密度を上回る密度で細胞を播種することはできますか? また、一般的な初代細胞が耐えうるDMSOの最低希釈値を教えてください。

#01039プロトコルではDnaseⅠを使用することが推奨されていますが、DNaseⅠの使用は必須でしょうか。また、取り除くタイミングがあれば教えてください。

#00861ロンザの皮膚細胞の単離部位を教えてください。

#01058RAFT™ 3D Cell Culture System で培養した場合と平面培養時の蛍光免疫染色でのプロトコルの違いを教えてください。

#01057RAFT™ 3D Cell Culture System のゲルで培養した細胞で蛍光免疫染色を行う場合、RAFT™ ゲルによりバックグラウンドが高くなることはありますか?

#01054RAFT™ 3D Cell Culture System で作製したゲルはどのように細胞培養するのですか?

#00883ロンザの成人由来のメラノサイトはエンドセリン-3(ET-3)を加えて培養していますが、新生児には培養されていません。なぜ相違があるのか教えてください。

#00865KGMTM-2, KGM-GoldTMとKGM-CDTMの相違点を教えてください。

#00864ロンザのケラチノサイトの角質細胞への分化を阻害する要因を教えてください。また、ケラチノサイトはカルシウム不含で培養することはできますか?

#00863ロンザのケラチノサイトの角質細胞への分化はどのように行えばよいでしょうか。

#00900ロンザの骨格筋細胞(SkMC)もしくは骨格筋筋芽細胞(HSMM)を筋管に分化した後、筋芽細胞に脱分化させることは可能ですか?

#00901ロンザの骨格筋細胞(SkMC)もしくは骨格筋筋芽細胞(HSMM)が筋管に分化した後、その状態で培養、維持、凍結保存することは可能ですか?

#00925ロンザで推奨する破骨前駆細胞（OCP）の培養容器を教えてください。

#00924ロンザの骨芽細胞(NHOst)の分化・機能を確認する推奨TRAPキットは販売されていますか?

#00902ロンザではなぜ骨芽細胞(NHOst)を分化する際、Hydrocortisone-21-hemisuccinate と β-Glycerophosphate の組み合わせで複数の濃度条件を検討するよう推奨しているのですか?

#00862ロンザの新生児のドナーから得られた皮膚細胞のドナー年齢を教えてください。

#00364現在使用している細胞用の最適化プロトコルでは、一定の播種密度で播種することが推奨されていますが、これよりも低密度で細胞を播種することはできますか?

#00902ロンザではなぜ骨芽細胞(NHOst)を分化する際、Hydrocortisone-21-hemisuccinate と β-Glycerophosphate　の組み合わせで複数の濃度条件を検討するよう推奨しているのですか?